Лабораторна діагностика туберкульозу і микобактериозов

А. Г. Хоменко

Виявлення мікобактерій туберкульозу в різному патологічному матеріалі від хворих має вирішальне значення для постановки діагнозу туберкульозної інфекції.

Саме виявлення збудника туберкульозу є основним і безперечним критерієм, який свідчить про специфічну природу захворювання. Виявлення мікобактерій має вирішальне значення не тільки для діагностики туберкульозу, воно надзвичайно важливо при прогнозуванні перебігу процесу, виборі раціональної схеми лікування та правильній оцінці його ефективності.

Внаслідок широкого застосування хіміотерапевтичних препаратів в останні десятиліття відзначаються суттєві зміни багатьох властивостей мікобактерій туберкульозу: морфології самого збудника і його колоній на поживних середовищах, тинкторіальних властивостей, лікарської чутливості, вірулентності для певних видів тварин.

У той же час істотно розширилися знання про різноманітних формах існування збудника ( «видимі, але не ростуть», L-трансформовані, ультрамелкие авізуальние) і їх патогенетичної ролі- збільшилася питома вага микобактериозов, що викликаються нетуберкульозні (атиповими, опортуністичними, анонімними) кислотостійкими мікробактеріями. Це значно ускладнює і ускладнює мікробіологічну діагностику туберкульозу та вимагає комплексного підходу до оцінки її результатів.

мікобактерії туберкульозу - тонкі, прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1 -10 (частіше 1-4) мкм, шириною 0,2-0,6 мкм, гомогенні або зернисті з незначно закругленими кінцями. Вони нерухомі, не утворюють ендоспори, конідій та капсул. Морфологія і розміри бактеріальних клітин схильні до значних коливань і багато в чому залежать від віку мікроорганізму і особливо від умов його існування і складу живильного середовища.

Мікобактерії характеризуються вираженим різноманіттям форм існування, великим поліморфізмом і широким діапазоном мінливості біологічних властивостей (плеоморфизмом). Описано численні морфологічні варіанти мікобактерій: гігантські форми з колбовідних потовщеними розгалуженнями, ниткоподібні, міцеліеподобние і булавоподібні, діфтероідние і антимикотические форми. На підставі зазначеного морфологічного різноманіття в сучасній мікробіологічної класифікації визнана встановленої філогенетична зв`язок збудника туберкульозу з променистими грибами, що отримало відображення в назві виду, роду і сімейства - мікобактерії.

З огляду на, що збудник туберкульозу є неспороносні, має паличкоподібну форму і належить до нижчих грибів, VI Всесоюзний з`їзд фтизіатрів рекомендував дотримувати терміну «мікобактерії туберкульозу» (mycos - гриб, bacterium - паличка). У зв`язку з цим не слід називати збудник туберкульозу бацилою, так як бацилами називаються мікроорганізми, здатні утворювати спори.

Численними дослідженнями доведено здатність мікобактерій утворювати фільтрівні форми, «видимі, але не ростуть» форми з ослабленою життєздатністю, некіслотоустойчівие форми. Однак біологічна і патогенетична роль цих форм остаточно не з`ясована. Отримано багато нових даних про дефектних по клітинній стінці L-формах мікобактерій, описані їхні біологічні властивості і вивчена патогенетична роль при різних клінічних проявах процесу і в експерименті [Хоменко А. Г., Дорожкова І. Р., Земскова 3. С., Карачунскій М. А., 1968-1990].

Поряд з мінливістю морфології мікобактерій туберкульозу властива широка мінливість і інших ознак, зокрема вельми характерного для них ознаки кислотоустойчивости. Кислотостійкість складається з двох властивостей: поганого сприйняття забарвлення і її збереження при знебарвлюється дії кислот, підстав і спиртів. Це явище характерне для всіх видів мікобактерій, за яку вони отримали назву кислото-, спирто- і щелочеустойчівий. Дана властивість має першорядне значення для мікобактерій, так як на ньому засновані практично всі методи бактериоскопического і культурального виявлення та ідентифікації мікроорганізму.

Кислотостійкість обумовлена високим вмістом в мікробної клітці міколових кислоти, що входить до складу ліпідних комплексів і знаходиться в з`єднанні з високомолекулярним спиртом - фтіоціролем. Останній є складовою частиною воскових субстанцій мікобактерії. Кислотостійкість виявляється за допомогою тільки спеціальних методів забарвлення, основним з яких є метод Циля - Нільсена. При фарбуванні за Цілем - Нільсеном кислотостійкі мікробактерії туберкульозу виглядають яскраво-червоними на синьому тлі препарату.

В результаті впливу несприятливих умов існування, а також ряду лікарських речовин і хіміотерапевтичних засобів мікобактерій можуть повністю або частково втрачати властивість кислотоустойчивости. Це веде до утворення змішаної, що складається з кислото- і некіслотоустойчівих особин або повністю некіслотоустойчівой популяції. Такі тинкторіальними змінені мікобактерії не виявляються звичайними бактеріоскопічного методами (при фарбуванні мазків за Цілем - Нільсеном), але виявляються іншими спеціальними способами. Тому на сучасному етапі питання про припинення бактеріовиділення у хворих на туберкульоз, які лікувалися протитуберкульозними препаратами, має вирішуватися тільки на підставі даних, отриманих комплексними бактеріоскопічного і бактеріологічного методами.

Раніше рід Mycobacterium формально поділено на підроду і типи, однак згідно з останніми таксономическим досліджень і висновком Міжнародної робочої групи по таксономії мікобактерій, рід Mycobacterium в практичних цілях підрозділяється на 3 великі групи: I - повільно зростаючі, II - швидко зростаючі і III - організми, що пред`являють особливі вимоги до живильних середовищ, але не культивується in vitro [Runyon Е. Н. et ai., 1974- Runyon EH, 1987].

До I групи належать мікобактерії, які при оптимальних умовах харчування і температури дають на щільних середовищах зростання макроскопически видимих колоній через 7 днів і більше. До цієї групи належать види Mycobacterium tuberculosis, М. bovis, М. africanum, М. microti, а також ряд видів повільно зростаючих мікобактерій, які класифікуються як нетуберкульозні: М. kansasii, М. marinum, М. simiae, М. gastri і ін . до II групи належать мікобактерії, що дають на щільних середовищах зростання видимих неозброєним оком колоній протягом менше 7 днів. До них відносяться види М. phlei, М. vaccae, М. diernhoferi, М. smegmatis, М. fortuitum і ін. До III групі відносяться не ростуть на поживних середовищах збудники прокази М. leprae, М. lepraemurium, М. haemophilum.

Основними методами лабораторної діагностики туберкульозу є класичні мікробіологічні методи: бактеріоскопія- культуральне дослідження, або посев- біологічно проба на чутливих до туберкульозної інфекції лабораторних тварин. Кожен із зазначених методів має певні переваги і недоліки, що дозволяє в кожному конкретному випадку диференційовано підходити до їх застосування.

Збір матеріалу для дослідження. Дотримання правил збору, зберігання і транспортування діагностичного матеріалу має дуже важливе значення, так як від цього залежить не тільки достовірність отриманих результатів, а й епідеміологічна безпека оточуючих.

Матеріал для дослідження на наявність мікобактерій туберкульозу збирають в стерильні контейнери (скляні банки) з щільно кришками. Застосування герметизованих контейнерів переслідує двояку мету: запобігання просочування вмісту і забруднення навколишнього хворого середовища надзвичайно стійкими до фізичних дій мікобактерій і ізоляцію зберігається в контейнері досліджуваного матеріалу від широко розповсюджених вегетуючих в навколишньому середовищі кислотостійких бактерій.

Для дослідження може бути використаний різноманітний патологічний матеріал: харкотиння, аспірат, вміст бронхів і інші матеріали, одержувані при бронхоскопіческом дослідженні, промивні води бронхів і шлунка, ексудати, гній, виділення ран, спинномозкова рідина, кров, сеча, операційний матеріал, змиви з предметів , органи експериментальних тварин.

У хворих з легеневими формами процесу об`єктом дослідження частіше служить мокрота. Збір мокротиння - дуже відповідальний етап діагностичної процедури, від чіткого проведення якого багато в чому залежить результат дослідження. Крім того, в момент відкашлювання мокроти створюється дуже високий ризик повітряно-краплинного поширення інфекції. У зв`язку з цим бажано, щоб збір мокротиння проводився по можливості на віддалі від інших людей - на відкритому повітрі або в окремій, добре вентильованого кімнаті. Зазвичай у хворих, що виділяють слиз в достатній кількості, для дослідження збирають ранкову порцію. Якщо хворий виділяє мало мокротиння, її слід збирати протягом доби, при цьому обов`язково зібраний матеріал зберігати в холодильнику. Якщо дослідження проводиться на тлі лікування, за 2 доби до збору мокротиння прийом протитуберкульозних препаратів скасовується.

Відео: Актуальні питання профілактики та ранньої діагностики туберкульозу

Згідно з рекомендаціями, розробленими Міжнародною спілкою по боротьбі з туберкульозом (1976), збір мокротиння повинен проводитися в присутності і за безпосередньої участі середнього медичного персоналу. При цьому особам, відповідальним за збір мокротиння, слід керуватися наступними правилами:

1. Пояснити хворому причини дослідження і необхідність відкашлювати вміст глибоких відділів дихальних шляхів, а не збирати в контейнер слину або носоглоткову слиз. Необхідно також попередити хворого, що він повинен попередньо почистити зуби і прополоскати порожнину рота кип`яченою водою, що дозволяє механічно видалити основну частину мікрофлори, вегетуючій в ротовій порожнині.
2. Присутній при зборі мокротиння медичний працівник повинен відкрити стерильний контейнер, зняти з нього кришку і передати хворому тільки донну частину контейнера.
3. Стоячи позаду хворого, слід рекомендувати йому тримати контейнер якомога ближче до губ і відразу ж спльовувати в нього мокроту в міру її відкашлювання.
4. По завершенні збору мокротиння медичний працівник повинен оцінити її кількість і якість-контейнер з порцією мокротиння достатнього обсягу (не менше 3-5 мл), що містить ущільнені або гнійні грудочки без слини, ретельно закривають кришкою, що загвинчується, маркують і поміщають в спеціальний ящик для транспортування в лабораторію.

У тому випадку, якщо хворому не вдається відразу виділити необхідну кількість мокротиння, слід підбадьорити його і порадити зробити повторні кашлеві спроби, так як багато хворих не можуть відразу протягом декількох хвилин виділити мокроту з глибоких відділів дихального тракту. У разі, якщо і відстрочена спроба одержати мокротиння виявляється невдалою, необхідно видалити контейнер і піддати його обеззаражіванію- вимити руки з милом і видати хворому новий стерильний контейнер для збору ранкової порції мокротиння. Попередньо треба переконатися в тому, що хворий правильно зрозумів всі вимоги і правила збору мокротиння та користування контейнером, а також проінструктувати хворого, що він повинен якомога раніше доставити мокроту в лабораторію - негайно після її збору.

Якщо ж хворий не виділяє мокроту або виділяє її тільки епізодично і в убогому кількості, то напередодні і рано вранці в день збору мокротиння хворому слід дати відхаркувальний засіб або застосувати дратівливі аерозольні інгаляції. Останні провокують посилення секреції бронхів, кашель і виділення мокротиння. Для аерозольних інгаляцій користуються портативними аерозольними інгаляторами типу АІ-1. Як ингалируемой суміші рекомендується 15% розчин хлориду натрію в 1% розчині бікарбонату натрію (150 м NaCl і 10 м NaHCCb на 1 л дистильованої води).

Оскільки ингалируемого розчин викликає посилену саливацию ще до появи кашлю з мокротинням, то хворий повинен видалити слину в спеціально приготовлену посуд з хлораміном і тільки після цього зібрати мокротиння для мікробіологічного дослідження. Гиперсекреция бронхіального вмісту у більшості хворих спостерігається ще протягом доби після аерозольної інгаляції, що має бути використано з метою отримання матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу. Тому хворому рекомендують зібрати мокротиння для другого дослідження протягом доби після інгаляції.

Якщо при дратівливою інгаляції чомусь не вдається одержати мокротиння, то використовують промивні води бронхів або шлунка. Останній метод застосовується переважно у дітей молодшого віку, які погано відкашлюють мокроту і часто заковтують її. Даний метод може виявитися корисним також у хворих з пригніченим ванілевим рефлексом, у яких не вдається отримати матеріал навіть при провокують інгаляціях.

Збір промивних вод бронхів проводиться лікарем-отоларингологом. Промивні води шлунка беруть натщесерце за допомогою товстого зонда, попередньо давши хворому випити або ввівши через зонд 100-150 мл розчину бікарбонату натрію (питної соди) з метою нейтралізації кислої реакції шлункового вмісту. Промивні води шлунка повинні досліджуватися негайно, щоб виключити шкідливу дію на збудника шлункових ферментів.

Більш цінним матеріалом для дослідження при відсутності мокроти є аспірати з трахеї і бронхів, бронхоальвеолярного лаважу рідина, а також матеріали прицільної катетер- і щіткової біопсії, одержувані при бронхологіческіх дослідженнях.

Ексудати з плевральної порожнини, виділення ран, аспірати і пунктати із закритих натечника, гнійних вогнищ, асцитичної рідина та інші матеріали повинні бути взяті у хворого з дотриманням всіх правил асептики, поміщені в стерильний посуд і доставлені в лабораторію. Відносно цих матеріалів практикується двоякий підхід. У більшості лабораторій застосовується стандартна техніка знезараження, що має на увазі забруднення зазначених матеріалів неспецифічної гноеродной флорою. Поряд з цим в деяких лабораторіях практикують попередні посіви на бульйон Хоттингера з 0,5% глюкози, щільних середу Тароцці (0,15%) і кров`яний агар для того, щоб визначити супутню флору і, отже, необхідність спеціальної обробки.

Особливої методичного підходу вимагає дослідження менструальної крові. Наявність в цьому матеріалі великої кількості протеолітичних, фібринолітичних та інших ферментів вимагає негайної доставки матеріалу в лабораторію і ретельної його обробки, так як менструальна кров є вельми сприятливим середовищем для мікробної флори.

Особливої уваги потребує збір сечі. Для дослідження використовують зазвичай середню порцію ранкової сечі, отриманої після ретельного туалету зовнішніх статевих органів розчинами антисептиків (слабкий розчин перманганату калію, риванолу та ін.). Сечу центрифугують, осад використовують для мікроскопії і обрабативаают 3-5% розчином сірчаної кислоти, але не лугом. Збір добової сечі для бактеріологічного дослідження малораціонален. При накопиченні сечі протягом доби неможливо зберегти її стерильність.

Зберігання ємності з сечею в холодному місці може призвести до випадання солей, що несприятливо відбивається на подальшій обробці осаду. Крім того, в сечі містяться бактерицидні продукти, які можуть не тільки пригнічувати життєздатність мікобактерій, але протягом доби навіть зруйнувати мікробні клітини. Встановлено, що при зберіганні сечі після збору більше 1 ч число мікробних клітин неспецифічної мікрофлори збільшується в кілька разів. Ферменти життєдіяльності цієї флори можуть пригнічувати ріст мікобактерій.

І, нарешті, при зборі сечі протягом тривалого часу слід мати на увазі можливість попадання в неї кислотостійких сапрофітів, що може привести до діагностичних помилок. В цьому відношенні особливо обережно повинні оцінюватися результати дослідження сечі, отриманої від чоловіків, так як в ній можуть виявлятися Mycobacterium smegmatis і інші атипові мікобактерії, які помилково можуть бути прийняті за мікобактерії туберкульозу.

Об`єктом дослідження можуть служити також шматочки тканин, отриманих під час операції, або органи експериментальних тварин. Такий матеріал, взятий стерильно, поміщають в ступку, ретельно подрібнюють за допомогою стерильних ножиць, потім розтирають товкачем, поступово додаючи 5-7 мл стерильного ізотонічного розчину NaCl, а потім обробляють 3-5% сірчаною кислотою. Обробка шматочків тканин лугом не рекомендується, так як вона менш ефективна і викликає, крім того, розрідження тканинних структур з утворенням густого тягнеться суміші, погано піддається центрифугированию і іншим наступним маніпуляціям.

Зберігання, консервація і транспортування діагностичного матеріалу. У протитуберкульозних закладах функціонують спеціалізовані лабораторії, що виробляють бактеріологічні дослідження. В стаціонарах стерильні контейнери з мокротою або іншим патологічним матеріалом доставляються безпосередньо в лабораторію. Збір матеріалу від амбулаторних хворих проводиться, як зазначено вище, під безпосереднім наглядом середнього медичного працівника. У разі невдачі такого збору хворому видають стерильну посуд, проводять інструктаж, і на наступний день вранці хворі доставляють зібраний ними за добу матеріал в лабораторію.

Якщо в лікувальному закладі не проводяться дослідження для виявлення кислотостійких мікобактерій, зібраний діагностичний матеріал повинен централізовано доставлятися в лабораторію, де він буде досліджуватися. Зазвичай така доставка здійснюється 1 або 2 рази на тиждень. Отже, матеріал повинен накопичуватися протягом декількох днів. Для цього використовують бікси або спеціальні транспортувальні ящики, що вміщають 10-20 контейнерів, які зберігаються в холодильнику.

Під час транспортування матеріал повинен оберігатися від впливу прямих сонячних променів і тепла. Якщо транспортування і зберігання займають не більше 48 ч, матеріал можна пересилати без консерванту. У літній період і в районах з теплим кліматом необхідна консервація, якщо транспортування займає більше 24 ч. З цією метою можна застосовувати 2-3% розчин борної кислоти в співвідношенні 1: 1 або гліцерин. Як консервант можна також використовувати 10% розчин трехзамещенний фосфату натрію або 0,05-0,1% розчин хлоргексидин біглюконат в співвідношенні 1: 1 в цих випадках посів матеріалу виробляють без подальшої обробки. Зростання мікобактерій може бути отриманий навіть після зберігання мокротиння з консервантом при 30 ° С протягом 10-12 днів.

В умовах Крайньої Півночі діагностичний матеріал при тривалому транспортуванні можуть порушити значних коливань температури. При цьому необхідно враховувати, що допускається пересилання матеріалу в замороженому стані без консерванту. Це забезпечує збереження життєздатності мікобактерій протягом 8-15 днів, однак ні в якому разі не можна допускати повторне відтавання і заморожування матеріалу, які сприяють зниженню життєздатності мікобактерій.

Режими і кратність обстеження хворих. Режими і кратність лабораторного дослідження для виявлення мікобактерій туберкульозу можуть значно варіювати не тільки в залежності від різних підходів і точок зору клініцистів і бактеріологів, але (в більшій мірі) і від клінічного стану та форми процесу, етапи спостереження хворого і, нарешті, цілей самого дослідження (верифікація специфічної природи захворювання, визначення ступеня активності процесу, динамічне спостереження за ефективністю лікування, етапна перевірка груп диспансерного спостереження та ін.).

Проте, відповідно до рекомендацій Міжнародного союзу по боротьбі з туберкульозом (1976), при першому зверненні хворого до лікаря і підозрі на туберкульозну інфекцію необхідно досліджувати не менше 3 порцій мокротиння: порції, отриманої при першому зверненні хворого до лікувального учрежденіе- ранньої ранкової порції мокротиння , зібраної хворим на наступний день протягом перших 1-2 годин після пробудження і підйому-другий порції, зібраної вранці того ж дня, але пізніше - в період доставки в клініку першої ранкової порції.

У нашій країні більшого поширення набула інша схема, що передбачає не менше ніж 3-кратне протягом 3 послідовних днів дослідження мокротиння або іншого патологічного матеріалу. У вперше виявлених хворих (особливо з малими клінічними формами процесу) бажано підвищити кратність дослідження до 4-6, так як подібна практика істотно збільшує число позитивних результатів. Такий комплекс досліджень проводиться при надходженні хворого в стаціонар або ж при взятті на диспансерний облік. В подальшому, в процесі лікування мікробіологічні дослідження проводять регулярно, не рідше 1-2 разів на місяць з метою визначення динамічних змін складу і масивності мікобактеріальній популяції, ступеня активності процесу, ефективності лікування та прогностичних критеріїв.

Особливо ретельно слід проводити дослідження при вирішенні питання про абаціллірованія хворого перед переведенням його в III групу диспансерного обліку (неактивний туберкульоз органів дихання) і перед зняттям з обліку. Порядок, терміни і кратність бактеріологічних обстежень осіб, які перебувають на обліку протитуберкульозних диспансерних закладів, регламентуються спеціальними методичними документами та наказами МОЗ РФ.

бактериоскопическое дослідження. Воно є одним з основних і найбільш поширених методів. Переваги його полягають в простоті, дешевизні і швидкості отримання результатів. Однак можливості методу обмежені. У препараті можна виявити поодинокі мікобактерії, якщо в 1 мл матеріалу міститься не менше 10 000-100 000 бактеріальних клітин (межа методу). При меншій кількості клітин бактериоскопия може виявитися недостатньо чутливою для їх виявлення.

У таких випадках застосовують різні методи «збагачення» або «накопичення» мікобактерій. Найбільшого поширення з них отримав метод флотації, при якому мікобактерії витягують з водної суспензії досліджуваного матеріалу за допомогою вуглеводнів або інших рідин з меншою, ніж у води, відносною щільністю (ксилол, толуол, бензин, бензол). Цей метод підвищує частоту виявлення мікобактерій більш ніж на 10% в порівнянні зі звичайною прямий бактеріоскопії.

Приготування мазків для бактеріоскопічного дослідження є вельми відповідальною процедурою, багато в чому зумовлює успіх дослідження. При цьому необхідно мати на увазі, що це одна з найнебезпечніших процедур. Туберкульоз поширюється повітряно-крапельним шляхом через дрібні крапельки розміром близько 5 мкм, що містять збудник, які при вдиханні в легенях можуть досягати альвеол і осідати в них, формуючи осередок інфекції. У лабораторній роботі зусилля повинні бути спрямовані на те, щоб уникнути або звести до мінімуму небезпеку зараження при тих маніпуляціях, при виконанні яких спостерігається найбільша небезпека розсіювання потенційно інфекційних аерозолів.

Основними джерелами утворення таких аерозолів в лабораторіях є маніпуляції, які пов`язані з приготуванням мазків для бактеріоскопії: 1) відкривання контейнерів з матеріалом- ця маніпуляція особливо небезпечна, якщо між зовнішньою стінкою шийки контейнера і внутрішньою поверхнею кришки знаходяться частинки висохлої мокроти або якщо безпосередньо перед відкриттям контейнер піддавався встряхіванію- 2) приготування мазків шляхом нанесення матеріалу на предметне скло і розподіл його по поверхні скла-3) прожи ание бактеріологічних петель, що використовуються для перенесення матеріалу на скло. При виконанні цих маніпуляцій слід дотримуватися особливої обережності.

Мазки для бактеріоскопічного дослідження готують з нативної необробленої мокротиння. Для цього мокроту переливають в чашку Петрі, під дно якої підкладена чорна папір. Поруч з чашкою поміщають два чистих (раніше не були в ужитку) і заздалегідь промаркованих предметних скла. За допомогою двох препаровальной голок, бактеріологічних петель або добре загострених дерев`яних паличок (для кожної проби мокротиння - нових) вибирають 5-6 найбільш щільних гнійних грудочок мокротиння, переносять їх на скло, покривають зверху другим склом, злегка притискають і, розсовуючи скла в різні боки , розтирають до отримання рівномірного тонкого шару. Мазок повинен займати 2 з- 1 4 скла. Під час приготування мазків слід дотримуватися максимальної обережності, щоб уникнути утворення бризок і виходу матеріалу за краї скла.

Приготовлені мазки поміщають на 15-30 хв на фільтрувальну папір для просушування при кімнатній температурі. Оскільки не завжди вдається уникнути попадання матеріалу на краю скла, то папір, на якій для просушування розкладають мазки, слід вважати зараженої. Висохлі скла пінцетом або спеціальними щипцями беруть за кінець, на якому нанесено маркування, і 3 рази проводять через полум`я спиртівки або газового пальника (загальна тривалість перебування мазка в полум`я не повинна перевищувати 3-5 с), а потім поміщають на чисту папір або спеціальний піднос .

Доцільним і в плані охорони праці, особливо рекомендованим є метод, запропонований Hain. Предметні скла з мазками, розташовані на жерстяних підносах, поміщають в стерилізатор і перш за все висушують при 37 ° С. Потім температуру підвищують до 105 ° С і через 10 хв стерилізатор вимикають. Цим досягаються надійне прикріплення мазка до скла і загибель мікобактерій, як знаходяться в матеріалі і по краях стекол, так і потрапили на піднос. Температура не повинна перевищувати 105 ° С, щоб не змінити тинкторіальних властивості мікобактерій. З метою більшої безпеки мазки з мокроти можна робити з осаду після обробки матеріалу.

Мазки з рідкого патологічного матеріалу (Бронхоальвеолярний змиви, промивні води бронхів або шлунка, сеча, пунктати з закритих порожнин, ексудати і ін.) Готують з осаду матеріалу, отриманого після обробки його кислотою або лугом з подальшим відмиванням або нейтралізацією і центрифугуванням. Висушені і фіксовані мазки забарвлюють. При виборі забарвлення враховують метод мікроскопії, за допомогою якого буде здійснюватися бактеріоскопічне дослідження: звичайний світловий (масляна іммерсія) або люмінесцентний (флюоресцентная мікроскопія) мікроскоп.

Відео: Лікарі розробили спосіб високоточного діагностування туберкульозу Вести Новосибірськ _ NSKTV

Найбільш вживаним і поширеним методом забарвлення для виявлення кислотостійких мікобактерій є спосіб Циля - Нільсена. При одночасному впливі нагрівання і сильного протравлюючого речовини фенолу (карболової кислоти), на якому готується основне барвник фуксин, полегшується проникнення анілінового барвника в мікробну клітину і особливо в структури її клітинної стінки, що складається з ліпідів і міколових кислот. Звичайні анілінові барвники не сприймаються мікобактеріями, і останні не фарбуються. Подальше знебарвлення мазка в 29% розчині сірчаної кислоти або 3% розчині солянокислого спирту призводить до знебарвлення всіх некіслотоустойчівих структур.

Тільки мікобактерії, що володіють вираженою кислото- і спиртостійкі, стійко утримують барвник і залишаються пофарбованими в червоний колір. Знебарвлені елементи мазка дофарбовують метиленовим синім. Мікобактерії виявляються в препараті у вигляді тонких, прямих або злегка вигнутих яскраво-червоних паличок, іноді розташованих під кутом у вигляді римської цифри V, часто купками або невеликими скупченнями. Нерідко в тілі паличок або окремо від них виділяються поодинокі темніші зерна або їх скупчення (зернисті форми).

При мікроскопії мазків слід враховувати широкий поліморфізм мікобактерій туберкульозу, особливо при дослідженні матеріалу від хворих, які отримують протитуберкульозні препарати. У зв`язку з тим що широке застосування хіміопрепаратів змінює морфологію мікобактерій, в ряді випадків при дослідженні препаратів можуть виявлятися і гіллясті форми нерівномірного ширини, і бліднокрашених палички, і осколки мікобактерій, і окремі кислотостійкі зерна або їх скупчення.

Крім того, в мазках з осаду сечі, промивних вод шлунка і іншого матеріалу поряд з мікобактеріями туберкульозу можуть виявлятися і кислотостійкі сапрофіти, зокрема в сечі - мікобактерії сперми, які легко сплутати з мікробактеріями туберкульозу. У сумнівних випадках рекомендується мазок тривалий час (45-60 хв) знебарвлювати в солянокислом спирті або жавелевой воді. При такому методі знебарвлення сапрофіти втрачають своє забарвлення і виглядають у вигляді паличок блакитного кольору (в результаті докрашіванія мазка після знебарвлення метиленовим синім).

Правильна мікроскопія препаратів є відповідальною процедурою і вимагає високої кваліфікації і великого досвіду мікроскопісти, так як на підставі результатів мікроскопії ставиться діагноз, уточнюються ефективність лікування і прогноз захворювання.

Мікроскопію забарвлених препаратів виробляють в світловому мікроскопі з імерсійним об`єктивом 90 і окуляром 10 (збільшення 900). Бажано використовувати бінокулярний мікроскоп з об`єктивом 100. На перегляд зазвичай потрібно в середньому близько 5 хв. Цього часу достатньо, щоб переглянути не менше 100 полів зору і виявити поодинокі мікобактерії.

Згідно з рекомендаціями Міжнародного союзу по боротьбі з туберкульозом (1976), перегляд препарату слід починати в центральній частині лівого краю мазка, поступово пересуваючись вправо уздовж довгої осі мазка. Підраховано, що переглянувши послідовно в цьому напрямку 100 полів зору, мікроскопісту просунеться на 2 см. В деяких випадках бактеріоскопії 100 полів зору виявляється недостатнім для обґрунтованого висновку про кількість збудників, що виділяються хворим. У таких випадках рекомендується досліджувати не менше 300 полів зору.

В останні роки досить широке поширення отримав метод люмінесцентної мікроскопії. Він заснований на відмінності світіння мікроскопіруемого об`єкта в ультрафіолетовому або короткохвильовому спектрі видимого світла. В основі застосування цього методу для диференціації мікобактерій туберкульозу лежить здатність ліпідів цих бактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. Залежно від застосовуваних барвників мікобактерії туберкульозу дають чітке яскраво-червоне свічення на зеленому тлі або золотисто-жовте - на темно-зеленому тлі.

Відео: Звіряючи життя по Урсова

Цим методом можна досліджувати будь-який матеріал, крім сечі, в якій можуть бути сапрофіти, важко диференціюються при такій забарвленням. Останні мають зеленуватий або апельсиновий відтінок. Найбільш широко поширені методи забарвлення акридиновим помаранчевим по Адамчик і забарвлення аурамін-родаміном.

При мікроскопії мазків по люмінесцентному методу висока контрастність мікроскопічної картини дає можливість проводити дослідження при малих збільшеннях. При такій мікроскопічної системі збільшується одномоментно переглядається поле зору (в порівнянні з иммерсионной мікроскопією). Це дозволяє виявляти поодинокі мікобактерії і робить люмінесцентний метод особливо цінним при дослідженні олігобаціллярного матеріалу. Люмінесцентна мікроскопія значно скорочує час, що витрачається на знаходження одиничних мікобактерій туберкульозу, дозволяє швидко переглянути весь препарат і, отже, підвищити число знахідок.

Порівняльні дослідження одних і тих же препаратів, забарвлених за методом Ціля - Нільсена і люмінесцентними барвниками, показали значно більш високу інформативність люмінесцентного методу, яка, за даними різних авторів, коливається від 9-10 до 19%.

Позитивний Некількісні відповідь мікроскопії зазвичай дається в тому випадку, якщо в препараті виявляється не менше 3 мікобактерій. Однак в разі позитивного результату однозначної відповіді «позитивний» або «негативний» в даний час для клінічних цілей недостатньо. Застосовується кількісна оцінка масивності бактеріовиділення.

Кількість виявлених в мазках мікобактерій є вельми важливим показником, що відображає ступінь заразність хворого. У сучасній хіміотерапії легеневого туберкульозу кількісна оцінка бактеріовиділення служить одним з методів визначення ефективності лікувальних заходів. Зменшення в процесі хіміотерапії вегетирующей мікобактеріальній популяції трактується як хороший прогностичний ознака, тоді як тривале стабільне бактеріовиділення або тенденція до його збільшення розглядається як невдачі лікування та вимагає негайної зміни лікувальної тактики.

Для кількісної оцінки мікобактеріальній популяції використовують бактериоскопический і культуральний методи. Результативність цих методів близька, але нерівнозначна. Швидкість отримання інформації при застосуванні бактериоскопического методу складає його незаперечну цінність в порівнянні з культуральним методом. Однак останній більш повноцінно характеризує мікробну популяцію не тільки з кількісної, але і з якісної сторони.

Встановлено, що результати багаторазових бактеріоскопіческіх досліджень патологічного матеріалу наближаються до результативності методу посіву, особливо у хворих з хронічними деструктивними формами туберкульозу. Застосування двох методів в сукупності дозволяє більш точно кількісно оцінити ступінь бактеріовиділення.

В основу застосовуваних в даний час методів кількісного обліку мікобактерій у препараті покладено метод, запропонований учнями Коха - Гаффкой і Стінкеним. Цей метод увійшов в літературу як метод Гаффкі в модифікації Стінка. Збирається мокрота, що виділяється хворим за 24 год. Після вимірювання її кількості мокротиння піддається обробці і засівається на поживні середовища за допомогою кількісного методу, а з осаду, крім того, готується мазок. Для цього на предметне скло наносять 0,05 мл осаду мокротиння, і ця кількість розподіляють у вигляді мазка діаметром 15 мм на заздалегідь відкаліброваному на склі ділянці.

Мазок забарвлюють за Цілем - Нільсеном і переглядають під мікроскопом не менше 100 полів зору. Число мікобактерій в кожному полі зору записують в спеціальній сітці. Потім підраховують середнє число мікобактерій в одному полі зору. Японськими авторами встановлено, що при діаметрі мазка 15 мм і збільшенні мікроскопа 630 раз (окуляр 7, об`єктив 90) в такому мазку міститься постійне число полів зору, відповідне 10 000. Для визначення числа мікобактерій запропонована спеціальна формула Берні (1969). Шляхом порівняно нескладних розрахунків по ній можна визначити загальне число мікобактерій, виділених хворим з мокротою щодоби в залежності від кількості мокротиння.

Однак слід визнати, що метод Гаффкі - Стінка досить складний, вимагає багато часу і великої точності. Тому запропоновані різні модифікації цього методу, що полегшують його виконання і прискорюють дослідження. Так, в Центральному НДІ туберкульозу РАМН розроблена комплексна методика кількісного визначення масивності бактеріовиділення (КОМБ), яка передбачає одночасне використання бактериоскопического і культурального методів.

У схему дослідження входить бактериоскопия дозованого мазка з осаду мокротиння, пофарбованого за Цілем - Нільсеном, визначення числа мікобактерій в 100 полях зору, посів матеріалу на живильні середовища Левенштейна - Йенсена і Фінна-II з подальшим підрахунком колоній, що виросли. Масивність мікробної популяції при баатеріоскопіі оцінюють за двома ступенями: 1) мізерне бактеріовиділення - в дозованому мазку виявляється 1-9 мікобактерій в 100 полях зору-2) рясне - від 10 до 100 мікобактерій в 100 полях зору.

Існують і інші схеми оцінки масивності бактеріовиділення. Міжнародний союз по боротьбі з туберкульозом дотримується такої схеми кількісної оцінки. Підрахунок виявляються кислотостійких мікобактерій виробляють в межах до 50 мікробних особин при мікроскопії. При цьому можуть спостерігатися такі варіанти:

• Виявлено 50 мікобактерій менш ніж в 100 полях зору, тобто раніше, ніж мікроскопісту завершив перегляд однієї довжини мазка. Запис: більше 50 в 1 довжині - gt; 50/100 в поле зору;
• Від 10 до 50 мікобактерій виявлено в 1 довжині мазка. Вказується абсолютне число: 36/100 в поле зору.
•  Від 0 до 10 мікобактерій виявлено в 1 довжині мазка. В цьому випадку необхідно продовжити дослідження і переглянути
• 3 довжини (300 полів зору). Можливі 3 варіанти:
• виявлено 50 мікобактерій- запис 50 / gt; 100 в поле зору;
• виявлено менше 50 мікобактерій- вказується їх кількість: 29/300 в поле зору;
• не виявлено мікобактерій- запис: 0/300 в поле зору.

Можна провести аналогію цих результатів з більш звичними
для нас поняттями рясного (масивного), помірного і мізерного бактеріовиділення:

Відео: 2.2. Лабораторна діагностика туберкульозу

• gt; 50/100 в поле зору - відповідає рясного,
• 10-50 / 100 в поле зору - помірного і
• 50/300 в поле зору - мізерне бактеріовиділення.

Клінічне значення визначення масивності бактеріовиділення не викликає сумнівів. Встановлена пряма кореляція між масивністю мікобактеріальній популяції, частотою розвитку лікарської стійкості мікобактерій і обсягом деструктивного процесу у хворих на туберкульоз.

У осіб з хронічними формами туберкульозу легень при обмежених деструктивних ураженнях відзначається менш інтенсивне бактеріовиділення (у 50% хворих спостерігається відсутність або невелика кількість мікобактерій в мокроті), більш рідкісне розвиток лікарської стійкості до протитуберкульозних препаратів і більш часте припинення бактеріовиділення в процесі лікування.

При поширеному деструктивному туберкульозі легень більшість хворих виділяють масивну бактеріальну популяцію, яка містить в 63-78% випадків стійких в протитуберкульозних препаратів мікобактерій. У цих хворих в 2 рази рідше настає припинення бактеріовиділення в результаті хіміотерапії. Терміни зникнення мікобактерій туберкульозу з мокротиння в певній мірі корелюють з масивністю бактеріовиділення до початку хіміотерапії.

Відзначено, що позитивна бактеріологічна динаміка, що виявляється в різкому зниженні мікобактеріальній популяції і повному її зникнення з мокротиння, дещо випереджає рентгеноморфологических ознаки інволюції процесу. Саме в цей період на тлі зникнення типових бактеріальних форм збудника найбільш легко і демонстративно виявляються різноманітні якісні зміни мікобактерій, які у виникненні різних форм біологічної мінливості мікроба.

Слід зазначити також, що на тлі інтенсивної протитуберкульозної хіміотерапії (особливо з включенням до складу лікувальних комбінацій рифампіцину) в останні роки відзначається феномен появи в мазках з різноманітного патологічного матеріалу видимих під мікроскопом і добре забарвлюються за Цілем - Нільсеном мікобактерій, які під впливом лікарських препаратів на насправді втратили життєздатність і здатність розмножуватися на поживних середовищах. Цей феномен отримав в літературі назву «видимі, але нерастущіе мікобактерії».

Для виявлення цих мікроорганізмів японські дослідники Murohashi і Yoshida (1957) запропонували метод забарвлення «на живі і мертві». Метод заснований на різному фарбуванні ДНК мікробної клітини у живих і загиблих мікобактерій. В останніх вона знаходиться в деполімеризовані стані і втрачає здатність забарвлюватися деякими аніліновими основними барвниками (зокрема, метиленовим зеленим), проте сприймає додаткову забарвлення піроніном, сафранін або карболовим фуксином. На пофарбованому препараті живі життєздатні мікобактерії зелені, а загиблі, не здатні до розмноження, - червоні.

Таким чином, для виявлення мікобактерій є кілька бактеріоскопіческіх мазків. Вони досить прості, загальнодоступні і дозволяють отримати відповідь в максимально короткий термін. Однак вони не дають повної впевненості ні при позитивному, ні при негативному результаті бактеріоскопії і тому, як правило, супроводжуються більш чутливим і результативним методом дослідження - методом посіву.

Метод посіву, або культуральний метод виявлення мікобактерій. Цей метод відрізняється великою чутливістю і має ряд переваг перед методом мікроскопії. Він дозволяє виявити мікобактерії туберкульозу при наявності в досліджуваному патологічному матеріалі декількох десятків життєздатних особин. Якщо порівняти цю цифру з 10 000-100 000 мікробних тіл, присутність яких необхідна в 1 мл матеріалу для бактеріоскопічного виявлення, то стане зрозумілою значно більш висока чутливість методу посіву. Це особливо важливо при дослідженні матеріалу від вперше виявлених або вже лікувалися хворих, що виділяють малі кількості мікобактерій.

Дуже важливою перевагою методу культурального дослідження є можливість отримання культури збудника, яка може бути детально досліджена, ідентифікована і вивчена щодо її лікарської чутливості, вірулентності та інших властивостей. Однак необхідно відзначити, що існує ряд факторів, що обмежують широке застосування методу культивування, зокрема його висока вартість, відомі обмеження, пов`язані зі складністю обробки патологічного матеріалу, повільним розмноженням мікобактерій туберкульозу і, отже, необхідністю довго чекати результатів дослідження.

Все це знижує цінність методу, не дає можливості оперативно використовувати отримані результати в клініці і диктує необхідність проведення широкого пошуку як більш досконалих методів, так і більш досконалих поживних середовищ, які дозволили б прискорити отримання результатів і підвищити ефективність і чутливість методу.

Бактеріологічному дослідженню піддається найрізноманітніший матеріал: харкотиння, промивні води бронхів і шлунка, ексудати, виділення ран і свищів, сеча, спинномозкова рідина, матеріали біопсії і бронхоальвеолярного лаважу, органи експериментальних тварин і патологоанатомічний матеріал. Матеріал для дослідження повинен доставлятися в лабораторію в стерильному добре закритому посуді.

Перед посівом на поживні середовища матеріал попередньо обробляють, що переслідує двояку мету: 1) максимально гомогенізувати матеріал, який підлягає дослідженню, з тим щоб наявні в ньому мікобактерії рівномірно розподілилися в його обсязі, чим полегшується їх виделеніе- 2) необхідно «придушити» всі інші мікроорганізми (гноєродниє і гнильні), що містяться в матеріалі дослідження, з тим щоб в подальшому вони як більш швидко зростаючі не заважали росту мікобактерій і не використали приготовлені для мікобактерій питати Патерналізм речовини середовища.

З цією метою для обробки патологічного матеріалу перед посівом на поживні середовища використовують різні реактиви. Це повинно забезпечувати гомогенізацію матеріалу, повністю пригнічувати ріст неспецифічної гноеродной і гнильної мікрофлори, яка може перебувати в досліджуваному матеріалі, і максимально зберігати життєздатність присутніх в матеріалі мікобактерій. Перед посівом досліджуваний матеріал потрібно сконцентрувати і звільнити від супутньої гноеродной мікрофлори. Для цього мокротиння, ексудати і інший матеріал поміщають в стерильну склянку з намистом або битим склом і обробляють лугом або кислотою. Рідкі матеріали попередньо центрифугують, і подальшій обробці піддають тільки осад.

В даний час для обробки патологічного матеріалу застосовують такі методи і детергенти:

1. Метод Гона - обробка розчинами сірчаної кислоти (2-6%) в залежності від характеру матеріалу і ступеня його забрудненості неспецифічної мікрофлорою з подальшим центрифугуванням і відмиванням.
2. Метод Петрова - обробка 4% розчином NaOH з наступним центрифугуванням і нейтралізацією осаду перед посевом- цей метод зручно використовувати при обробці тварин великої кількості посівів. Луг розчиняє білкові частинки, що сприяє швидкій гомогенізації мокротиння та інших матеріалів, що містять гній і слиз, і вивільненню з цих білкових частинок мікобактерій туберкульозу.
3. Обробка 3% розчином сірчаної кислоти протягом 20 хв (10 хв в спокійному стані, 10 хв при центрифугуванні) з подальшим 3-кратним відмиванням осаду стерильним фізіологічним розчином.
4. Обробка 1% розчином сірчаної кислоти після ретельної гомогенізації протягом 18-20 год при кімнатній температурі (метод Б. Я. Циммер).
5. Обробка 10% розчином трехзамещенний фосфату натрію. Це широко поширений в нашій країні метод, що допускає тривалу експозицію матеріалу з фосфатом натрію без порушення життєздатності мікобактерій, що особливо цінно в тих випадках, коли доставка матеріалу утруднена. Трехзамещенний фосфат натрію добре пригнічує супутню флору і навіть при 2-3-денному зберіганні матеріалу не пошкоджує мікобактерії і мало впливає на їх здатність до зростання на поживних середовищах. Метод можна застосовувати в двох модифікаціях: з нейтралізацією матеріалу або без нейтралізації. В останньому випадку до осаду після центрифугування додають 1 мл рідкого середовища Школьникової і отриману суміш повністю засівають на поживні середовища.
6. При посіві сильно забрудненого матеріалу використовують більш концентровані розчини сірчаної кислоти (5%).

Для культивування мікобактерій туберкульозу використовують різні поживні середовища: щільні, напіврідкі, рідкі (синтетичні і напівсинтетичні). Однак жодна з них не володіє якостями, що висуваються до них сучасної бактеріологічної діагностикою туберкульозу. У зв`язку з цим для підвищення результативності культурального методу рекомендується застосовувати посів патологічного матеріалу одночасно на кілька (2-3) поживних середовищ. Для виділення чистих культур мікобактерій туберкульозу найчастіше застосовують різні за складом щільні поживні середовища.

Як стандартна середовища для первинного виділення збудника і визначення його лікарської чутливості ВООЗ рекомендована середу Левенштейна - Йенсена. Це щільна яєчна среда, на якій хороший ріст мікобактерій туберкульозу отримують на 15-25-й день після посіву бактериоскопически позитивного матеріалу.

В останні роки широке поширення в нашій країні отримала яєчного середовища II, запропонована Е. Р. Фінном (середа Фінна-2). Вона відрізняється від середовища Левенштейна - Йенсена тим, що замість L-аспарагіну в ній використовується глутамат натрію. На цьому середовищі зростання мікобайтерій туберкульозу з`являється на кілька днів раніше, ніж на середовищі Левенштейна - Йенсена. Відсоток виділення культур на цьому середовищі на 6-8% вище, ніж на середовищі Левенштейна - Йенсена. Для підвищення ймовірності отримання зростання мікобактерій рекомендується засівати патологічний матеріал на 2-3 різні за складом живильні середовища одночасно.

В даний час, крім безаспарагіновой середовища Фінна-2, в практику впроваджується ще одна безаспарагіновая середовище, розроблена В. А. Анікіна. За даними Московського НДІ туберкульозу, застосування середовищ, сбалансірбванних за сольовим складом і джерелами азотистого харчування інакше, ніж середовище Левенштейна - Йенсена, культуральная діагностика туберкульозу поліпшується в середньому на 6,7%. Це особливо важливо при таких формах туберкульозу, при яких збудник паразитує в умовах ацидозу і анаеробіозу, зокрема, при туберкульозі сечостатевих органів.

Для підвищення результативності культурального методу поряд із застосуванням одночасно декількох різних за складом поживних середовищ для посіву рекомендується повторне багаторазове дослідження матеріалу, так як в даний час відзначається стан олігобаціллярності у більшості хворих навіть з свежевиявленних деструктивними ураженнями в легких. Олігобаціллярность проявляється не тільки малою кількістю збудників в діагностичному матеріалі, але і транзиторні, епізодичні їх виділення. Тому часто посів навіть на 3 різні поживні середовища не забезпечує повної інформації про стан бактеріовиділення.

Для підвищення інформативності культурального методу практикується повторне багаторазове дослідження матеріалу від хворих. За даними Центрального НДІ туберкульозу, методика 3-кратного первинного комплексного дослідження бактеріоскопічне і культуральними методами у вперше виявлених хворих на деструктивний туберкульоз легень дає додатково 3,4% позитивних результатів, а у хворих на хронічний деструктивний туберкульоз, лікувалися до надходження в стаціонар, - 5,8 % в порівнянні з даними одноразового дослідження.

Однак, за даними ряду авторів, і 3-кратні посіви недостатні для виявлення справжньої картини бактеріовиділення. Так, встановлено, що при обстеженні нелечівшіхся хворих максимальний приріст інформації про бактеріовиділення можна отримати при 6-кратного повторних посівах матеріалу, при цьому кількість позитивних результатів зростає на 36-37% в порівнянні з даними 3 кратного посіву. У хворих після 3-місячного лікування цінність багаторазового дослідження патологічного матеріалу методом посіву зростає і при 6-кратному дослідженні показник приросту позитивних результатів може досягати 70%, а після 6 місяців лікування він зростає до 82%.

Таким чином, кратність дослідження і склад поживних середовищ мають важливе значення для культуральної діагностики туберкульозу. У зв`язку з тим що в процесі інтенсивної хіміотерапії відбувається пошкодження різних метаболічних систем мікробної клітини, ряд мікроорганізмів в мікобактеріальній популяції втрачає здатність нормально розвиватися на поживних середовищах. Відзначається зниження життєздатності мікобактерій, що може проявлятися відсутністю зростання на загальноприйнятих поживних середовищах, а також виникненням здатності рости тільки на осмотически збалансованих (напіврідкі або навіть рідкі) поживних середовищах.

Так, за даними І. Р. До ріжкової, в процесі інтенсивної протитуберкульозної хіміотерапії частина мікобактеріальній популяції, втрачаючи здатність рости на щільних поживних середовищах, в той же час набуває властивість рости на напіврідких поживних середовищах, утворюючи мікроколонії в верхньому найбільш аеруючих ділянці живильного середовища. Ця потреба в підвищеній аерації чітко проявляється також при культивуванні мікобактерій в рідких поживних середовищах зі збільшеною аерацією, яка досягається при культивуванні посівів в обертовому термостаті (Н. М. Макаревич).

Після посіву і закриття пробірок матеріал повинен бути розподілений по всій поверхні живильного середовища, для цього пробірки нахиляють. Пробірки повинні перебувати в горизонтальному положенні протягом 24-48 год, після чого їх слід перевести у вертикальне положення.

Посіви потрібно переглядати щотижня. При цьому обов`язково реєструються параметри: а) поява зростання - термін появи, починаючи з дня посева- б) інтенсивність росту - число колоній, цей показник має велике діагностичне та прогностичне значення, особливо якщо посіви виробляються в дінаміке- в) забруднення посіву сторонньої мікрофлорою або грібамі- г) відсутність зростання.

При первинному посіві бактериоскопически негативного матеріалу на щільні середовища середня тривалість росту становить 20-46 днів. Окремі штами ростуть 60 і навіть 90 днів. Це змушує витримувати посіви в термостаті протягом 3 міс, щотижня перевіряючи появу зростання.

Зазвичай вірулентні культури мікобактерій туберкульозу ростуть на щільних поживних середовищах в вигляді R-форм колоній різної величини і виду. Колонії сухі, зморшкуваті, кольору слонової кістки, але в разі дисоціації можуть зустрічатися і вологі, злегка пігментовані колонії, рожево-жовтий пігмент яких різко відрізняється від оранжевого або жовтого пігменту сапрофітних або атипових мікобактерій. Останні зазвичай ростуть в S-формі. Слід зазначити, що на середовищі Фінна-2 колонії мікобактерій туберкульозу можуть бути більш вологими. Після курсу хіміотерапії від хворих на туберкульоз можуть виділятися гладкі колонії з вологим ростом (S-форми). Гладкі колонії характерні також для Mycobacterium bovis, які також патогенні для людини.

Позитивна відповідь дають тільки після мікроскопії мазка з колоній, що виросли, пофарбованого за Цілем - Нільсеном. В мазках виявляються яскраво і темно-червоні палички, що лежать поодиноко або групами, що утворюють переплетення у вигляді «повсті» або «кіс», часто видно темні зерна, особливо в довгостроково зростаючих культурах. У молодих культурах мікобактерії туберкульозу (особливо виділені від хворих, які тривалий час лікувалися хіміопрепаратами) часто відрізняються великим поліморфізмом, аж до появи коротких, майже коккоподібних форм.

Інтенсивність зростання позначають по 4-бальною системою: + поодинокі колонії-++ від 20 до 100 колоній- +++ від 100 до 200 колоній- ++++ несосчітиваемое число колоній (зливний ріст). У двох останніх випадках є рясне бактеріовиділення, яке є показником активності процесу і / або неефективності лікування.

Якщо морфологія колоній або паличок викликає сумніви в їх туберкульозну природу або культури виділені з матеріалу, який може містити кислотостійкі сапрофіти (сеча, гній з вух та ін.), Мазки додатково обесцвечивают спиртом (протягом 45-60 хв) або жавелевой водою (в протягом 1-2 год). Слід враховувати, що молоді культури мікобактерій туберкульозу можуть знебарвлюватися спиртом і жавелевой водою, так як вони ще слабо кислотостійких. У таких випадках культури слід витримати ще кілька днів (5-10) в термостаті і знову повторити мікроскопічне дослідження, щоб переконатися в їх кислотоустойчивости.

Авірулентние сапрофітні і атипові мікобактерії зазвичай грубіше, товщі, іноді менш інтенсивно забарвлені і, як правило, не утворюють жгутообразних сплетінь (корд-фактор відсутній). Однак деякі види атипових мікобактерій (фотохромогенние) можуть рости в R-формі. Багато атипові і сапрофітні мікобактерії мають кислотостійкі зерна, дуже подібні до таких у вірулентних мікобактерій туберкульозу.

У тих випадках, коли виділяються культури, викликають сумніви в плані їх приналежності до мікобактерій туберкульозу, їх вивчають, використовуючи комплекс спеціальних досліджень, що дозволяють диференціювати типові мікобактерії туберкульозу від нетуберкульозних (атипових) мікобактерій і кислотостійких сапрофітів.

Як зазначалося вище, в разі появи на поживних середовищах зростання колоній і встановлення за допомогою мікроскопії забарвлених за Цілем - Нільсеном мазків факту, що виросла культура відноситься до кислотостійким мікобактерій, проводиться кількісна оцінка результатів посіву. З цією метою застосовують різні схеми оцінки (одна з них наведена вище).

У Центральному НДІ туберкульозу використовують кількісну оцінку бактеріовиділення методом посіву по 3 ступенями:

1. убоге - на щільних поживних середовищах виростає 1-20 колоній у всіх пробірках, використаних для даного посіву;
2. помірне - від 21 до 100 колоній у всіх пробірках;
3. рясне - виявляється зростання більше 100 колоній у всіх пробірках.

При лабораторній діагностиці туберкульозу недостатньо дати відповідь, який констатує, виявлені чи ні тим чи іншим методом мікобактерії туберкульозу. Для клініки туберкульозу, детального уявлення про характер мікобактеріальній популяції і визначення прогнозу захворювання необхідно вивчення різних властивостей культур, виділених від хворого: лікарської чутливості, ферментативної активності, вірулентності, видової приналежності. У деяких випадках необхідно диференціювати виділені культури і встановити характер атипових культур. Все це обумовлює те різноманітність досліджень, які необхідно проводити при лабораторній діагностиці туберкульозу.

Визначення лікарської чутливості виділених штамів мікобактерій є необхідним і дуже важливим етапом мікробіологічних досліджень. Розвиток лікарської стійкості обумовлено багатьма факторами: селекцією стійких варіантів в мікобактеріальній популяції, вегетирующей в організмі хворого-індукцією протитуберкульозними препаратами або антибіотиками, застосовуваними в процесі хіміотерапіі- передачею епісомного R-фактора чутливим особам (Нехромосомна стійкість) і ін.

Слід зазначити, що зниження чутливості мікобактерій туберкульозу відзначається до всіх протитуберкульозних препаратів, проте воно може відрізнятися за ступенем, характером, частоті і швидкості появи. Відомо, що з патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз виділяються неоднорідні по лікарської чутливості мікобактерії: стійкі до одного лікарського препарату, або моноустойчівие, варіанти з істинною подвійний або поліустойчівостью, а також суміш варіантів, стійких до різних препаратів.

Визначення спектру і ступеня чутливості мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів має важливе значення для тактики хіміотерапії хворих, контролю за ефективністю лікування і визначення прогнозу захворювання. Ступінь лікарської чутливості мікобактерій туберкульозу визначається відповідно до встановлених критеріїв, які залежать як від протитуберкульозної активності лікарського препарату, так і його концентрації в осередку ураження, величини максимальної терапевтичної дози, фармакокінетики препарату та ін.

Визначення лікарської чутливості в даний час проводиться бактеріологічними методами - методом розведень на щільному живильному середовищі і методом розведень (або абсолютних концентрацій) на рідких поживних середовищах. Є багато модифікацій обох методів. Як уніфікованого в Росії застосовують рекомендований Комітетом з хіміотерапії ВООЗ метод визначення лікарської чутливості мікобактерій на щільному середовищі Левенштейна - Йенсена (без крохмалю), в яку перед згортанням додають різні концентрації препаратів. Мінімальний набір складається з 2-3 пробірок з різними концентраціями кожного з використовуваних в даній клініці препаратів, однієї контрольної пробірки з середовищем без препарату.

Цей метод досить точний. Він дозволяє застосовувати патологічний матеріал, що містить будь-яку кількість мікобактерій, оскільки для визначення лікарської чутливості використовуються мікобактерії, попередньо виділені з патологічного матеріалу.

Оскільки терміни виділення збудника на живильних середовищах становлять не менше 1-1,5 міс, результати визначення лікарської чутливості зазначеним методом можна отримати не раніше ніж через 2-2,5 міс після забору матеріалу. У цьому полягає один з основних недоліків методу. Описаний метод визначення лікарської чутливості мікобактерій після виділення їх чистої культури отримав назву непрямого методу.

При масивному бактеріовиділення (не менше 1-5 мікобактерій в кожному полі зору) застосовують пряме визначення лікарської чутливості при виділенні збудника безпосередньо з патологічного матеріалу. Для цього використовують метод глибинного посіву і метод культивування на стеклах в рідких поживних середовищах. Ці методи більш трудомісткі, вимагають додаткового приготування мазків, забарвлення і микроскопирования останніх і, крім того, менш точні, так як неможливо дозувати засів мікобактерій. Однак результати можна отримати в більш короткі терміни (через 12 днів). Практикується також пряме визначення лікарської стійкості на щільних середовищах, в цьому випадку результати можна отримати через 3 тижні.

Лікарсько-чутливі штами дають зростання на середовищах з препаратами в межах певної концентрації, різної для кожного препарату. Штами, які ростуть при відповідно більш високому вмісті цих препаратів в живильному середовищі, відносять до лікарсько-стійким. Стійкість визначають за наявністю макроскопически видимого зростання на щільних і мікроскопічного зростання - на рідких середовищах.

Стійкість даного штаму в цілому виражається тією максимальною концентрацією препарату (кількість мікрограмів в 1 мл живильного середовища), при якій ще спостерігається розмноження мікобактерій (по числу макроколоній при посіві на щільні середовища і мікроколоній при посіві на рідкі середовища). Лікарсько-стійкі мікроорганізми здатні розмножуватися при такому вмісті препарату в середовищі, яке надає на чутливі особини бактеріостатичну або бактерицидну дію. При визначенні лікарської стійкості мікобактерій на щільних середовищах культура вважається чутливою до тієї концентрації препарату, яка міститься в середовищі, якщо число колоній мікобактерій, які виросли на одній пробірці з препаратом, не перевищує 20. Тільки при наявності більше 20 колоній культура розцінюється як стійка.

Для різних препаратів встановлена певна гранична концентрація, при якій ще спостерігається розмноження чутливих до цього препарату мікобактерій. Кордоном, або критерієм стійкості, називають ті перші концентрації препарату в живильному середовищі, виражені в микрограммах на 1 мл, при яких починають розмножуватися стійкі особи. Для щільного середовища Левенштейна - Йенсена встановлені наступні концентрації (мкг / мл): стрептоміцин - 5 ізоніазид - 1 етіонамід - 30- протионамид - 30- циклосерин - 50 канаміцин - 30- флоримицин (біоміцин) - 30- тиоацетазон (тибон) - 2 етамбутол - 2 рифампіцин - 20.

Поряд з аналізом лікарської чутливості всі виділені при посіві повільно зростаючі штами мікобактерій підлягають первинній ідентифікації для визначення їх видової приналежності (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum, М. microti), так як приналежність збудника до того чи іншого виду істотно впливає на тактику хіміотерапії, прогноз захворювання та ін. Одним з основних лабораторних тестів, що дозволяють диференціювати М. tuberculosis і М. bovis і мікобактерії всіх інших видів, служить ніаціновий тест. Він заснований на унікальній здатності мікобактерій людського типу синтезувати ніацин (нікотинову кислоту) в значно більших кількостях, ніж мікобактерії бичачого типу і нетуберкульозні мікобактерії.

У разі виділення нетуберкульозних (атипових) мікобактерій, як повільно, так і швидко зростаючих, необхідно перш за все правильно оцінити їх роль в захворюванні, а потім ідентифікувати їх. Для встановлення діагнозу микобактериоза треба багаторазово повторно виділити один і той же вид мікобактерій. Всі туберкульозні мікобактерії підлягають спеціальному вивченню за допомогою бактеріологічних і біохімічних методів ідентифікації.

біологічна проба. При негативних результатах бактеріоскопії і посіву матеріалу, досліджуваного на мікобактерії туберкульозу, якщо все ж підозрюється туберкульоз, ставлять досліди на тваринах (так звана біологічна проба). Це найбільш чутливий метод виявлення збудника туберкульозу. Самим чутливим до туберкульозної інфекції лабораторним тваринам є морська свинка. Вважається, що зараження морської свинки дозволяє діагностувати туберкульоз навіть при наявності в матеріалі, використаному для зараження, 1-5 мікробних клітин.

Біологічний метод широко застосовується в діагностиці туберкульозу з часу відкриття збудника цієї інфекції. Він не втратив своєї цінності і в даний час. Більш того, зараз цей метод з успіхом застосовується для виявлення не тільки типових незмінених, а й різноманітних біологічно змінених форм збудника, зокрема L-трансформованих і фільтруються форм. Крім того, цей метод є основним при визначенні видової приналежності мікобактерій, їх вірулентності, вивченні патогенності атипових культур. Він широко використовується для відтворення туберкульозу окремих органів, дослідження алергічних реакцій, імунітету та ефективності хіміотерапії при туберкульозі.

При будь-якому методі зараження морських свинок мікобактеріями туберкульозу у тварин розвивається генералізований туберкульозний процес, який закінчується загибеллю. Однак слід мати на увазі, що збудники туберкульозу, стійкі до препаратів ізонікотинової кислоти, внаслідок зниження або втрати вірулентності можуть не викликати захворювання у морських свинок і дати негативні результати біологічної проби при одночасній наявності зростання на поживних середовищах при посіві. Ця обставина диктує необхідність диференційованого підходу до результатів біологічної проби і одночасного використання методу посіву при проведенні зараження тварини в діагностичних цілях.

Для підвищення частоти виявлення мікобактерій туберкульозу в патологічному матеріалі багато авторів використовують, крім підшкірного, інтратестикулярно зараження. При цьому в патологічному матеріалі вдається частіше виявляти ізоніазідоустойчівие слабовірулентнимі мікобактерії. Крім того, для підвищення чутливості біологічного методу рекомендується штучно знижувати природну резистентність морських свинок щоденним введенням великих доз кортизону (12,5 мг), що дозволяє підвищити результативність біологічної проби на 15-29% (за даними різних дослідників).

Нарешті, результативність біологічної проби можна підвищити, застосовуючи метод послідовних біологічних пасажів. Для цього зараження кожної наступної морської свинки проводиться гомогенатом органів від попереднього тваринного, використаного в біологічній пробі. У міру збільшення числа пасажів наростає вираженість специфічних змін в органах. Слід підкреслити, що особливу цінність біологічна проба являє для діагностичного дослідження олігобаціллярного матеріалу.

Перед зараженням морським свинкам з масою 200-250 г. ставлять реакцію Манту, вводячи 0,02 мл альттуберкулін Коха під шкіру в зовнішню поверхню стегна, звільнену від волосяного покрова- контроль - введення такої ж кількості бульйону в іншу лапку. При негативній реакції через 48 год свинку можна брати в досвід. Для зараження в діагностичних цілях можна використовувати різний патологічний матеріал: мокротиння, сечу, промивні води, виділення ран та ін.

Досліджуваний матеріал зазвичай обробляють 3% розчином сірчаної кислоти так само, як і для посіву. Потім осад 2 або (краще) 3 рази відмивають стерильним фізіологічним розчином NaCl і центрифугують. Таке відмивання