Бактеріологічна діагностика туберкульозу

А. І. Каграманов, Н. А. Шмельов, Є. Д. Тімашева, О. П Архипова

Для виявлення збудника туберкульозу в патологічному матеріалі в основному користуються бактеріоскопічного і бактеріологічного методами. Так як перший найбільш простий і доступний, його переважно і використовують, незважаючи на недостатню чутливість.

Бактеріологічний метод менш доступний і вимагає набагато більше часу (від 7 днів до кількох місяців), проте він застосовується при діагностичних дослідженнях, оскільки має часом вирішальне значення в постановці правильного діагнозу, наприклад, при диференціації непатогенних кислототривких сапрофітів від туберкульозних мікобактерій.

До бактеріологічному дослідженню зазвичай вдаються у випадках, коли бактериоскопический метод, включаючи і накопичення мікробів за допомогою флотації, дає негативні результати.Бактеріологіческій спосіб дослідження патологічного матеріалу розпадається на наступні етапи:

1. виділення чистої культури мікобактерій туберкульозу;
2. диференциация її від кислототривких сапрофітів;
3. біологічний метод дослідження (визначення вірулентності).

Виділення чистої культури мікобактерій туберкульозу здійснюють посівом досліджуваного матеріалу на живильні середовища. Слід при цьому мати на увазі, що мокрота, кал і т. П., Поряд з туберкульозними мікробактеріями, містять безліч інших мікробів, здатних швидко розмножуватися і пригнічувати ріст збудника туберкульозу. Тому туберкульозний матеріал до бактеріологічного дослідження слід звільнити від супутньої мікрофлори. Для цього користуються двома прийомами.

З одного боку, нестерильний патологічний матеріал попередньо (до посіву) обробляють 3-15% розчином сірчаної кислоти з метою знищення сторонніх мікробів, а з іншого - роблять посіви на яєчні середовища (Петраньяні, Любена-Гона, Левенштейна), що містять фарби, що затримують зростання сторонніх мікроорганізмів, але не перешкоджають розмноженню туберкульозних мікобактерій.

Відео: T-SPOT - найточніший метод діагностики туберкульозу

Виділена на яєчної середовищі культура в подальшому може зберігатися на інших середовищах. Посіви тримають в термостаті при 37-38 ° і спостерігають за появою зростання протягом 2-3 місяців, відзначаючи час появи перших ознак зростання. З вирослих колоній роблять пофарбовані мазки і перевіряють кислото- і спиртостійкі мікробів. Атипові колонії (пігментні, гладкі, швидко зростаючі, легко утворюють суспензію) отвівают на середовища для подальшого вивчення.

При відсутності росту протягом 8-10 тижнів беруть зішкріб з поверхні середовища і мікроскопією встановлюють наявність або відсутність мікрор. В позитивних випадках готують суспензію з зіскрібка і інфікують її морським свинкам для визначення вірулентності.

Виділення чистої культури з того чи іншого патологічного матеріалу має свої особливості головним чином в частині попередньої обробки з метою придушення життєдіяльності супутньої мікрофлори. Відповідно до цього наводимо опис. обробки кожного патологічного матеріалу окремо.

мокрота. Найбільш поширеним методом обробки матеріалу на туберкульоз є метод Гона. При цьому методі мокроту збирають в стерильні баночки в ранкові години або протягом доби. Вибирають з неї гнійні частки. Останні досліджують в забарвлених за Цілем і Граму мазках. Потім беруть близько 3 мл мокротиння (з гнійними грудочками), додають 6 мл 6-10% розчину сірчаної кислоти, енергійно протягом 10 хвилин струшують до повної гомогенізації, потім центрифугують стерильною центрифужной пробірці, рідину зливають, а осад сіють на яєчні середовища. Дія сірчаної кислоти (з моменту додавання до моменту посіву, включаючи і час центрифугування) має тривати 20 хвилин.

метод Мазура. В ряд широких пробірок наливають по 3 мл 2-3% розчину сірчаної кислоти. Потім, помістивши в пробірки гнійні грудочки мокротиння, гомогенизируют їх, помірно сильно б`ючи нижніми частинами пробірок про пружні поверхні (долоню, передпліччя, складене на столі рушник) протягом 3 хвилин. При цьому над емульсією мокротиння утворюється товстий шар піни, що містить суміш життєздатних туберкульозних мікобактерій і вбитих сторонніх мікробів. Частина такої піни сіють на яєчну середу.

Обробка гортанного мазка. У дітей та осіб, що не виділяють мокротиння, мікобактерії туберкульозу часто можна виявити в слизу з гортані. Останню знімають ватним тампоном, накрученим на нарізки злегка вигнутого металевого зонда довжиною 20 см і товщиною 1 мм. До вживання зонд з тампоном загортають у папір і стерилізують звичайним способом. Перш ніж взяти мазок, хворому пропонують покашляти і під контролем гортанного дзеркала тампоном знімають слиз з гортані. Потім тампон, знятий з зонда, поміщають в пробірку з 5 мл 6% розчину сірчаної кислоти, сильно протягом 5 хвилин струшують, після чого тампон видаляють стерильним пінцетом, попередньо віджавши з нього рідину в пробірку. Вміст пробірки центрифугують і осад сіють на яєчні середовища.

Промивні води шлунка. Промивні води шлунка рекомендують дослідити у дітей, які, як правило, не вміють відпльовуватися мокроту і зазвичай проковтують її, а також у дорослих, що не виділяють мокротиння або виділяють її в незначній кількості. У подібних випадках промивання шлунка і бактеріологічне дослідження осаду з цих вод виявляється найбільш чутливим методом виявлення збудника туберкульозу.

Промивні води отримують за допомогою шлункового зонда у хворих, яким вранці натщесерце дають випити склянку кип`яченої води. Випливає через зонд рідина збирають в стерильну обіцянками. Ці води нейтралізують 20% розчином двовуглекислої соди до нейтральної по лакмусу реакції, відстоюють 1-2 години (або центрифугують) і досліджують гнійні частки осаду так само, як мокроту. Обробку і посів промивних вод не слід відкладати, тому що через 6 годин після взяття матеріалу життєздатність туберкульозних бактерій під впливом шлункового соку помітно слабшає.

кал. Кал розтирають у стерильній ступці з дестіллірованной водою (5 м калу + 10 мл води) і залишають у спокої на 30 хвилин. За цей час великі частинки осідають на дно. Утворену на поверхні плівку знімають стерильною ложкою, яку змивають в пробірку 10 мл 4% розчину їдкого натру і витримують 3 години в термостаті при періодичному струшуванні. Після цього суспензія центрифугируют, осад нейтралізують по лакмусу декількома краплями 8-10% розчину соляної кислоти і сіють на яєчні середовища.

сеча. При дослідженні сечі слід пам`ятати, що мікобактерій туберкульозу в ній буває мало. Зазвичай беруть ранкову сечу, а іноді і добову. Для концентрації мікробів в невеликому обсязі користуються центрифугуванням зі швидкістю 3 000-6 000 об / хв всієї порції сечі. Осад зливають в одну пробірку і досліджують бактериоскопически. При відсутності сторонніх мікробів сіють без попередньої обробки сірчаною кислотою.

В іншому випадку додають, до осаду подвійний обсяг 6% розчину сірчаної кислоти, перемішують, центрифугують і сіють отриманий осад на яєчні середовища (обробка кислотою, включаючи процедуру центрифугування, триває 20 хвилин).

Гній, ексудат, спинномозкову рідину центрифугируют і осад, який не містить сторонніх мікробів, сіють на середовища. Якщо матеріал не стерильний, осад обробляють так само, як мокроту.

Обробка шматочків органів. Шматочки органів або залоз подрібнюють в стерильній ступці спочатку ножицями, а потім товкачем до кашкоподібної консистенції, додають 5 мл 6-10% розчину сірчаної кислоти. Продовжуючи діяти товкачем, перетворюють всю масу в суспензію. Останню центрифугируют і сіють на яєчні середовища. Процес обробки кислотою, включаючи процедуру центрифугування, повинен тривати 20 хвилин.

Обробка крові. До 5 мл стерильно взятої крові додають 3 мл 10% розчину лімоннокіслого натрію, ретельно перемішують струшуванням і залишають на 2-3 години для отримання осаду (або центрифугують). Плазму відсмоктують стерильною піпеткою, осад переносять в колбу з 40-50 мл дестіллірованной води, обережно перемішують круговими рухами колби, потім переливають в центрифужні пробірки, центрифугують 5-10 хвилин при 3 000 об / хв. Осад при центрифугуванні промивають дестіллірованной водою, змішують його з 1 мл 5% розчину сірчаної кислоти, струшують протягом 3 хвилин, додають 5 мл стерильної дестіллірованной води і знову центрифугують. Після цього осад змучують в 1 мл фізіологічного розчину і стерильною піпеткою сіють на живильне середовище.

Молоко. Для бактеріологічного дослідження беруть свіже молоко в кількості 30 мл. Його центрифугують протягом 15-20 хвилин при 3 000 об / хв. Осад сіють на живильне середовище після попередньої обробки сірчаною кислотою.

Прискорені методи дослідження матеріалу від хворих на туберкульоз

метод Школьникової. Нестерильний патологічний матеріал обробляють 5-8-10-12% розчином сірчаної кислоти близько 20 хвилин (включаючи процес центрифугування), як описано вище. Осад двічі при центрифугуванні промивають дестіллірованной водою (надлишок кислоти затримує ріст мікобактерій туберкульозу на кров`яний середовищі). Промитий осад засівають петлею в 3 пробірки з гемолітірованной кров`ю.

Гемолізовані кров готується наступним чином: 1 частина цитратной крові кролика або барана гемолізує додаванням 3 частин дестіллірованной води, після чого її розливають по 5 мл в пробірки. Можна користуватися донорською кров`ю, яка не містить консерванту.

Центрифужні опади матеріалів, вільних від сторонньої мікрофлори (ексудат, асцитическая і спинномозкова рідина і т. П.), Можна засівати в кров`яну середу без попередньої обробки кислотою. Посіви (по одній пробірці) досліджують на наявність росту на 7-й, 10-й або 20-й день, причому середа з посівом центрифугируется, осад промивається дестіллірованной водою при центрифугуванні для видалення кров`яного пігменту, що утрудняє забарвлення і мікроскопіровяніе препаратів, з промитого осаду робляться пофарбовані по Ціль-Нільсеном мазки. Цей метод більш чутливий порівняно зі звичайними посівами на яєчні середовища і, крім того, помітно прискорює отримання результатів.

метод Прайса. Виготовляють мазки з патологічного матеріалу на кількох добре знежирених і простерилізованих обпаленням предметних стеклах. Готові мазки спочатку занурюють на 5 хвилин в 6% розчин сірчаної кислоти, а потім промивають зануренням в стерильний фізіологічний розчин. Промиті препарати вносять в рідку живильне середовище (1 частина цитратной крові і 3 частини дестіллірованной води). Через 7-10 днів на мазках з`являється зростання у вигляді мікроколоній, які добре видно під мікроскопом на мазках, пофарбованих за Ціль-Нільсеном.

Мікобактерії туберкульозу і кислотостійкі сапрофіти

У патологічних продуктах іноді разом з бактеріями туберкульозу зустрічаються кислотостійкі сапрофіти. Деякі види сапрофітів відрізняються від туберкульозних мікобактерій тим, що легше знебарвлюються сумішшю спирту з кислотою. Однак ряд сапрофитов (наприклад, М. smegmae) не тільки кислотривкий, але і спіртоустойчів. Їх можна відрізнити від мікобактерій туберкульозу тільки по культуральним і патогенним властивостям. При інкубації в термостаті зростання проявляється через кілька днів, а не через 10-20 днів, як у туберкульозних мікобактерій- інокуляція кислотостійких сапрофітів морським свинкам не викликає у них патологічних змін.

біологічний метод

Найбільш чутливим до туберкульозу лабораторним тваринам є морська свинка, якою користуються при біологічному методі. За допомогою цього методу можна довести не тільки життєздатність, але і вірулентність мікобактерій туберкульозу, навіть при наявності одиничних мікобактерій в патологічному матеріалі.

Діагностичний матеріал, вільний від сторонньої мікрофлори (серозний ексудат, спинномозкова і асцитичної рідина і т. П.), Вводять свинкам без попередньої обробки в кількості 2-3 мл. Нестерильний матеріал (мокрота, гній, лужна сеча і т. П.) Попередньо обробляють 6-10% розчином сірчаної кислоти, як при підготовці матеріалу для посіву (див. На викладене вище про обробку патологічних матеріалів для культурального дослідження). Після кислотної обробки слід ретельно відмити залишки кислоти в діагностичному матеріалі за допомогою дворазового або триразового промивання фізіологічним розчином при центрифугуванні (введення погано промитого матеріалу викличе некроз на місці ін`єкції і навіть смерть піддослідної тварини).

Випробуваний матеріал вводять морським свинкам підшкірно в область паху в кількості 2-3 мл. Заражені діагностичним матеріалом морські свинки можуть жити до 6 місяців і довше. Для прискорення виявлення туберкульозу у свинок можна, не чекаючи настання смерті, взяти за допомогою пункції або надрізу частину вмісту з регіонарних пахових вузлів і інфільтрат на місці ін`єкції і досліджувати його в забарвлених мазках. Крім того, рекомендується перевірка свинок за допомогою туберкулінової проби. Виявлення типових туберкульозних мікобактерій в мазках і позитивна туберкулінова проба дають право диагносцировать туберкульоз у тварин до розкриття їх.

У випадках, коли патологічний матеріал, взятий у хворого з активною формою туберкульозу, не викликає генералізованого туберкульозу у морських свинок протягом 3 місяців, необхідно страхувати слабо уражені органи тваринного через нових тварин.

Визначення лікарської стійкості мікобактерій туберкульозу

Визначення лікарської стійкості збудника туберкульозу стає необхідним і важливим методом лабораторної роботи протитуберкульозних закладів.

Визначення стійкості можна виробляти:

1. «Прямим» методом в отриманому від хворого патологічному матеріалі (в мокроті, гнійному ексудаті), якщо в ньому бактериоскопически виявляють туберкульозні бактерії;
2. «Непрямим» методом, тобто з туберкульозними штамами, попередньо виділеними з патологічного матеріалу, якщо в останньому бактериоскопически туберкульозних бактерій не знаходять.

Визначення проводиться шляхом глибинного посіву на рідку живильне середовище з різним вмістом лікарської речовини і на ту ж середу без цієї речовини (контроль). При прямому методі засівається безпосередньо патологічний матеріал, а при непрямому - туберкульозна культура. Результати посіву враховуються через 14 і 21 день шляхом порівняння зростання на середовищі, що містить препарат, з ростом в контролі.

Схема техніки визначення лікарської стійкості до стрептоміцину (за методикою Московського обласного туберкульозного інституту). Готують різні розведення стрептоміцину в рідкому поживному середовищі. Для цього спочатку готують основне розведення стрептоміцину шляхом додавання 10 мл бідестіллірованной води у флакон, що містить 100 000 ОД сухого стрептоміцину: виходить зміст 10 000 ОД в 1 мл. З нього послідовно готуються наступні розведення:

1. до 0,5 мл цього розведення додають 4,5 мл живильного середовища (без плазми) - виходить розведення 1 000 ОД препарату в 1 мл;
2. до 0,1 мл розведення додають 0,9 мл живильного середовища - виходить 100 ОД в 1 мл;
3. до 5 мл другого розведення додають 5 мл живильного середовища - виходить 50 ОД в 1 мл;
4. до 4 мл третього розведення додають 16 мл живильного середовища - виходить 20 ОД в 1 мл;
5. до 10 мл четвертого розведення додають 10 мл живильного середовища - виходить 10 ОД в 1 мл;
6. до 8 мл п`ятого розведення додають 12 мл живильного середовища - виходить 4 ОД в 1 мл;
7. до 6 мл шостого розведення додають 6 мл живильного середовища - виходить 2 ОД в 1 мл;
8. до 3 мл сьомого розведення додають 9 мл живильного середовища - виходить 0,5 ОД в 1 мл.

Готується рідка живильне середовище наступного складу: двоосновний фосфат натрій (Na2 НРО4) -6,3 м одноосновної фосфорнокислий калій (КНГ Р04) - 1,4 м лимонно натрій 1,5 м сірчанокисла магнезія - 0,6 м аспарагин - 1 м дистильована вода - до 1 000 мл.

Аспарагин береться окремо в невеликій кількості води із загального колічества- все реактиви при підігріванні додаються послідовно, як зазначено в рецепті. Попередньо треба отримати повне розчинення кожного попереднього реактиву. Отримана суміш фільтрується, розливається у флакони по 100 мл і стерилізується в автоклаві. Після стерилізації середовища був мутніє, але потім прояснюється, тому середовищем можна користуватися через 1-2 діб після стерилізації. pH середовища при такому складі надаєте, рівним 7,0-7,2- в разі зменшення pH такої коригуються аміаком.

При відсутності аспарагина його можна замінити казеїновим гидролизатом в кількості 80 мл. Безпосередньо перед розливанням по пробірках до живильному середовищі додається нітратна плазма людської крові (без антисептиків) в кількості до 20% до загальної маси живильного арени.

На постановку кожного визначення потрібно 14 пробірок з розрахунку по 2 пробірки на кожну концентрацію і 2 пробірки контролю. Готове середовище розливається по 1 мл в усі пробірки. Потім в ці ж пробірки (крім контрольних) доливається по 1 мл з попередніх розведень стрептоміцину (8, 7, 6, 5, 4, 3).

Таким чином, в кожній пробірці виходить по 2 мл середовища, що містить відповідну робочу дозу стрептоміцину. Оскільки в кожну пробірку з розведенням стрептоміцину додається рівну кількість живильного середовища, то вихідна концентрація стрептоміцину зменшується вдвічі. У контрольні пробірки доливається по 1 мл живильного середовища без стрептоміцину і без плазми.

При «прямому» методі визначення стійкості в усі пробірки засівають по 0,2 мл емульсії патологічного матеріалу після попередньої обробки його за такою методикою: матеріал гомогенізується в стерильній банці з бусами, заливається подвійним об`ємом стерильного 10% розчину трехзамещенний фосфорнокислого натрію і витримується 24 години в термостаті при 37 °. Через добу весь вміст банки центрифугируется шляхом накопичення в 1-2 центрифужних пробірках, до осаду додається 3 мл живильного середовища без плазми- після ретельного змішування ця емульсія засівається по пробірках.

Якщо визначення проводиться «непрямим» методом, то засівається емульсія туберкульозної культури з щільною середовища, приготована на вищевказаної рідкому середовищі без плазми. Густота емульсії встановлюється по бактерійних стандарту, рівному 1 млрд. Мікробних тіл в 1 мл, або ж готується за вагою - 1 мг в 1 мл і засівається по 0,2 мл.

Засіяні пробірки парафінують і витримуються в термостаті 14 і 21 день. Облік результатів проводиться наступним чином-через 14 днів з термостата виймаються по одній пробірці кожної концентрації стрептоміцину і по одній контрольній пробірке- вміст пробірок центрифугируется і з осаду кожної пробірки готується мазок: висохлі мазю фіксуються 2% розчином сулеми протягом 5 хвилин (можна і звичайним прогреванием) і фарбуються за Ціль-Нільсену- результати визначення встановлюються по мікроскопічною картиною зростання (кількість типових мікроколоній у вигляді кіс, їх величину і зрілість порівнюють з ростом в контролі).

Результати визначення фіксуються через 14 днів в наступних випадках:

1. коли характерний мікроскопічний зростання туберкульозних бактерій виявляється при концентрації стрептоміцину не вище 1 ОД в 1 мл-подібні культури відносяться до чутливих, так як в таких випадках при більш тривалому витримуванні культур в термостаті зазвичай не спостерігається зростання на більш високих концентраціях;
2. коли вже через 14 днів характерний зростання відзначається при вмісті стрептоміцину, що дорівнює 10 ОД в 1 мл і вище-подібні культури є стійкими.

У разі, якщо до 14-го дня типовий мікроскопічний зростання виявляється при концентраціях стрептоміцину в 2 і 5 ОД в 1 мл, то результат визначення фіксується через 21 день, оскільки до цього терміну може з`явитися зростання і при більш високих концентраціях.

Оцінка отриманих результатів. Стійкість даного штаму в цілому виражається тією максимальною концентрацією стрептоміцину (кількість його ОД в 1 мл живильного середовища), при якій ще спостерігається зростання, за кількістю і зрілості мікроколоній наближається до зростання в контролі.

Штами, у яких подібне зростання спостерігається при концентрації стрептоміцину нижче 10 ОД в 1 мл живильного середовища, розцінюються як чутливі, що може бути виражено відповідними цифровими показниками: 0,25 ОД / мл, 1 ОД / мл, 2 ОД і 5 ОД в 1 мл.

Штами, що дають зростання, що наближається до зростання в контролі при концентрації стрептоміцину 10 ОД в 1 мл середовища і вище, відносяться до стійким і ступінь їх стійкості відповідно виражається показниками 10 ОД / мл, 25 ОД / мл і т. Д.

Визначення стрептоміціноустойчівості туберкульозних бактерій можна проводити також шляхом глибинного посіву безпосередньо патологічного матеріалу на кров`яні поживні середовища, користуючись описаними вище прискореними методами посіву по Школьникової або по Прайсу. В цьому випадку до живильному середовищі попередньо додається стрептоміцин в різних концентраціях (від 0,5 до 100 ОД в 1 мл).

Визначення фтивазид про стійкості проводиться в принципі за тією ж методикою, що і визначення стрептоміціноустойчівості. Розведення фтивазиду виробляються серійно, починаючи з 1:32 000 по 1:32 000 000. Чутливість культур до фтивазиду характеризується тим останнім розведенням, яке повністю затримує їх пост в середовищі.

Штами туберкульозних бактерій до лікування виявляються чутливими до фтивазиду в розведенні препарату від 1: 4 000 000 до 1: 8 000 000. У міру підвищення стійкості до фтивазиду зростання туберкульозних бактерій спостерігається відповідно до підвищення концентрації препарату (1: 2000 000, 1: 1 000 000, 1: 125000 і т. д.).